廢液抽吸與細(xì)胞培養(yǎng)|流程與方法
什么是廢液抽吸?
廢液抽吸(aspiration/suction)為現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)中常用的技術(shù)，用以移除廢棄液體。生物學(xué)中常見的細(xì)胞培養(yǎng)，是將真核或原核細(xì)胞培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)液(culture medium)及環(huán)境中，使其在受控制的狀態(tài)下生長(growth)及增殖(proliferation)的過程。細(xì)胞培養(yǎng)的流程包含解凍細(xì)胞、培養(yǎng)(cell culture)、繼代培養(yǎng)(俗稱分盤，cell subculture)及冷凍細(xì)胞等步驟。
然而，細(xì)胞生長過程中會產(chǎn)生代謝物、細(xì)胞碎片等廢棄物影響細(xì)胞健康，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需定期更換培養(yǎng)液，而移除舊有培養(yǎng)液、洗滌液的行為，則為廢液抽吸。
真空廢液抽吸裝置(suction system,aspiration system)常見如上圖，主要包含：
真空瓶(vacuum flask)
緩沖瓶(safety bottle)
過濾器(filter)
真空源(vacuum source)
連接并啟動真空源后，細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿中的廢液會因壓力差而被抽吸、收集至真空瓶，緩沖瓶則做為防溢裝置使用，以避免廢液被抽吸至真空源內(nèi)。過濾器可使用HEPA濾膜(High Efficiency Particulate Air filter或0.22µm過濾器，以過濾掉廢液及空氣中的粒子、確保抽吸效率。
細(xì)胞培養(yǎng)流程
▲細(xì)胞培養(yǎng)前，請確認(rèn)操作環(huán)境符合無菌操作條件，且應(yīng)避免和細(xì)菌實(shí)驗(yàn)共用設(shè)備，以防污染。
解凍細(xì)胞(thawing cells)：將冷凍細(xì)胞以37 oC快速解凍、回溫，以避免細(xì)胞損傷。
培養(yǎng)(cell culture)：依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，將細(xì)胞和培養(yǎng)基均勻混合后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
繼代培養(yǎng)(cell subculture)：當(dāng)細(xì)胞生長至一定程度后，收集細(xì)胞，分殖于新的培養(yǎng)基中。
進(jìn)行繼代培養(yǎng)時，其依細(xì)胞種類不同，處理方式可分為以下兩大類：
a.附著型細(xì)胞(adherent cell)，又稱貼壁培養(yǎng)、單層培養(yǎng)(monolayer culture)
去除舊培養(yǎng)基廢液
以Phosphate buffered saline(PBS)洗滌細(xì)胞一至二次
加入trypsin-EDTA溶液，于37 oC下作用2~20分鐘，使細(xì)胞可自培養(yǎng)瓶/皿中脫落
加入含有血清的新鮮培養(yǎng)基中，以終止胰蛋白酶作用
將脫落的細(xì)胞及其團(tuán)塊打散、混合均勻后，收集所有液體
離心后移除上清液，并添加新鮮培養(yǎng)基，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶/皿中進(jìn)行培養(yǎng)
b.懸浮型細(xì)胞(suspension cell)，又稱懸浮培養(yǎng)(suspension culture)
將細(xì)胞培養(yǎng)液以1000 rpm離心5分鐘后，吸除上清液
加入適量新鮮培養(yǎng)基，與沉淀細(xì)胞混合均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶/皿中進(jìn)行培養(yǎng)。
冷凍細(xì)胞(cryopreservation)：獲得目標(biāo)細(xì)胞株后，將細(xì)胞懸浮于含有5~10%DMSO(二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide)及30~50%FBS(胎牛血清，F(xiàn)etal Bovine Serum)的新鮮培養(yǎng)液中，以-80 oC或液態(tài)氮等低溫設(shè)備保存。
細(xì)胞計數(shù)(cell counting)：用以計算細(xì)胞濃度，可利用傳統(tǒng)血球計數(shù)器(Neubauer chamber)或自動計數(shù)器，計算細(xì)胞濃度可用來判斷目前細(xì)胞生長的情況。
廢液抽吸方法的比較
廢液抽吸目前有多種方法可以進(jìn)行。早期實(shí)驗(yàn)室多利用移液器(pipette)或電動吸管抽吸廢液，然而因?yàn)樾枰馗渤槲芭懦后w，長時間使用下來易造成手部不適及疲勞。除此之外，電動吸管須搭配無菌刻度吸管使用，而現(xiàn)多使用拋棄式吸管排除污染疑慮，因此一次實(shí)驗(yàn)下來通常會產(chǎn)生大量廢棄物，造成環(huán)境負(fù)擔(dān)。
現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室則普遍會自行購置真空幫浦搭配真空瓶自行組裝，如此會較電動吸管有效率，且設(shè)備取得較容易，然而自組式系統(tǒng)常見許多例如：管線配置不良，造成工作環(huán)境混亂、或是玻璃吸管經(jīng)常破裂等安全性上的缺點(diǎn)。
Lafil廢液抽吸系統(tǒng)及BioDolphin廢液抽吸套件主要為生命科學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)過程中溶液抽吸應(yīng)用，可直接放置于無菌無塵操作臺(laminar flow)使用。Lafil廢液抽吸系統(tǒng)整合真空源、真空瓶與廢液抽吸套件，提供實(shí)驗(yàn)室一體化解決方案，更比傳統(tǒng)廢液抽吸系統(tǒng)減少一半檯面占用面積，并使用圍籬式平臺固定真空瓶，避免操作者不小心碰觸瓶身而傾倒。
洛科Lafil廢液抽吸系統(tǒng)及BioDolphin廢液抽吸套件
實(shí)驗(yàn)室電動吸管 | 自組真空抽吸系統(tǒng) | 洛科廢液抽吸系統(tǒng) | ||
Lafil 100 | Lafil 200 | |||
整合式設(shè)計 | 是，單一產(chǎn)品 | 否 | 是，一體化all-in-one設(shè)計 | |
抽吸耗材 | 無菌刻度吸管 | 吸管尖 (tip) | 吸管尖 (tip) | |
長時間操作 | 易造成手部肌肉疲勞 | 易造成手部肌肉疲勞 | 符合人體工學(xué)、單手退tip設(shè)計 | |
吸力調(diào)節(jié) | 無 | 有 | 無 | 有 |
廢液清除 | 每次抽吸排淨(jìng) | 吸取至真空瓶滿後清除 | 吸取至真空瓶滿後清除 | |
真空瓶 | 無 | 通常為 1 L 抽氣瓶 | 1 L PP瓶 | 4 L PP瓶 |
幫浦/設(shè)備保護(hù) | 無 | 無 | 有 | |
廢液溢漏危險 | 無 | 高風(fēng)險 | 無 | |
置入無菌操作臺 | 可 | 不可 | 可 | 不可 |
空間利用性 | 體積小 | 管路雜亂佔(zhàn)空間 | 可省去自組系統(tǒng)50~65%空間 | |
環(huán)境友善 | 易產(chǎn)生大量拋棄式廢棄物 | 易產(chǎn)生大量拋棄式廢棄物 | 所有配件採用耐高溫高壓滅菌材質(zhì)，另有節(jié)能安靜的eco機(jī)種 | |
特殊需求 | 無 | 無 | Lafil 200：支援2人同時抽吸 | |
細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)備
無菌操作臺，或生物安全櫃 | 無菌操作臺可作為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的無菌工作區(qū)，同時也可遏止各種於微生物實(shí)驗(yàn)程序中可能產(chǎn)生的傳染性飛濺物或氣膠。 |
培養(yǎng)箱 | 使用培養(yǎng)箱的目的是為細(xì)胞生長提供舒適的環(huán)境。培養(yǎng)箱可透過控制溫度、濕度和二氧化碳濃度提供細(xì)胞適合的生長條件。 |
廢液抽吸系統(tǒng) | 使用廢液抽吸系統(tǒng)，可以更輕鬆地從細(xì)胞培養(yǎng)容器中吸除培養(yǎng)基和試劑。 |
光學(xué)顯微鏡 | 光學(xué)顯微鏡是細(xì)胞培養(yǎng)工具，如正立顯微鏡、倒立顯微鏡。其將細(xì)胞可視化，以監(jiān)測細(xì)胞生長情形、細(xì)胞形態(tài)、計數(shù)與識別污染物質(zhì)。 |
低溫儲存設(shè)備 | 隨著傳代次數(shù)的增加，連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞可能會出現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性，如遺傳漂變、哀老； 因此將它們保存在低溫儲存設(shè)備中以供長期儲存是細(xì)胞培養(yǎng)中重要的步驟。 |
水浴器 | 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室普遍會將水浴槽設(shè)置為37 oC，用於預(yù)熱培養(yǎng)基以及解凍冷凍細(xì)胞或試劑等。 |
廢液處理與廢棄辦法
含有危險化學(xué)品（如氯）之有機(jī)廢液應(yīng)收集至設(shè)有適當(dāng)標(biāo)示之專用廢液桶，不含危險化學(xué)品之其它廢液可一併收集于一般混合廢液桶，廢油則需收集于廢油桶中。細(xì)胞培養(yǎng)用的廢液應(yīng)加入適當(dāng)濃度的消毒劑，如漂白水(次氯酸鈉Sodium Hypochlorite)，使細(xì)胞致死，再倒入水槽或廢液桶。培養(yǎng)皿等生物醫(yī)療相關(guān)廢棄物則應(yīng)置于生物醫(yī)療廢棄物袋中，進(jìn)行高溫高壓滅菌后以一般廢棄物丟棄，或是請依照我國生物醫(yī)療廢棄物相關(guān)規(guī)定處理。
參考資料
Cell Culture Basics:Equipment,Fundamentals and Protocols|Technology Networks
Cell Culture Basics,EU(vanderbilt.edu)
Cell Culture Fundamentals:Safety Aspects of Cell Culture,Sigma-Aldrich
Cell culture protocol,Proteintech
Cell culture|細(xì)胞培養(yǎng)，ACE Biolabs
Laboratory Environmental Sample Disposal Information Document,Section 6.0,2010,US EPA
TISSUE CULTURE WASTE DISPOSAL GUIDELINES,2017,Laboratory Safety,THE GEORGE WASHINGTON UNIVERSITY
Tissue Culture Waste Disposal Guide,2022,EHS,Weill Cornell Medicine
行政院環(huán)境保護(hù)署，事業(yè)廢棄物貯存清除處理方法及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)，環(huán)署循字第1111016706號
細(xì)胞繼代培養(yǎng)，生物資源保存及研究中心-BCRC小教室
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